根据生物学重复数和文库大小优化RNA-seq差异基因表达分析 | 转录调控专题

RNA-seq是转录组学的革命性工具，可以对基因表达进行有效的全基因组定量。特别的一点，它是在两个或多个感兴趣的生物学条件之间寻找差异表达基因的首选方法。与DE分析有关的主要问题有3个，一个是找到最适合数据的概率模型，以及该模型的最佳参数估计。另一个重要问题是需要对数据进行标准化，以便评估和消除所有最终的技术误差和生物学偏见来正确比较两种不同的生物条件。最后一个，许多研究还强调了找到每种条件下的最佳生物学重复数和最佳文库大小的重要性。那么我们在进行DE分析时该如何解决这些问题呢？下面这篇文章给了我们答案：任何条件下的RNA-seq数据，我们都需要至少6次重复和15M reads才能获得数量相对稳定的真实差异基因，并且至少10次重复以上才能捕获到几乎所有的新的DE基因。接下来就让我们详细了解下作者是如何得出该结论的吧。 


论文标题：Optimization of an RNA-Seq Differential Gene Expression Analysis Depending on Biological Replicate Number and Library Size刊登日期：2018年02月发表期刊：Frontiers in Plant Science影响因子：6.627研究机构：法国图卢兹大学技术手段：RNA-seq、3款差异基因表达鉴定软件（DESeq、DESeq2、edgeR）原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00108/full





主要研究内容：01
番茄子房及幼果基因表达谱（TOGE）数据的DE基因数

作者收集番茄子房和生长4天后的幼果作为样本，分别设置了8个生物学重复。通过RNA-seq获得的DEGs如下图所示。基于文库大小和重复数，图1A、B分别显示了DEGs的数量变化；图1C、D则分别显示了DEGs数量的稳定性。结果发现文库大小对低表达基因数量的影响比高表达基因更大，而重复数对高/低表达基因数量的影响相同。对于所有基因，基于重复数的DEGs数量稳定性曲线的增加率（图1D）高于DE基因数曲线的增加率（图1B），而基于文库大小的DEGs数量稳定性曲线的增加率（图1C）和DE基因数曲线的增加率（图1A）基本一致。这表明增加重复数获得的稳健的DEGs的效益要高于增加文库大小获得的效益。

图102
TOGE数据的功率分析图2显示了番茄子房和幼果之间进行的DE功效分析。图2A、B分别基于文库大小和重复数显示了功效的演变，图2C、D则分别基于文库大小和重复数显示了功效的稳定性。与图1所得结果一样，重复数对高表达基因功效的影响远高于文库大小，低表达基因的功效则受到了两个参数同样的影响。图203
TOGE数据的敏感性（TPR）和特异性（FPR）接下来，作者分析了四种经典的DE分析方法（DESeq、DESeq2、两种来自edge R的R包的GLM和exact test方法）的灵敏度和特异性。结果显示四种方法种估计的真实DEGs几乎相同，其中DESeq方法的判定更严格，判定了全部DEGs的86%为真实DEGs。作者对于四种研究方法中的每一种，根据重复次数(2-7)以0.01为固定阈值来控制FDR的显著DE基因百分比(%DE)和估计的TPR和FPR值。此外对每种方法和每个重复次数下的估值随机重复30次。结果如图4A所示，DESeq2 捕获了更多的DEGs，并且所有四种方法的TPR都显著增加，7个重复时才捕获到几乎100%的DEGs。图4B显示，4种方法评估的FPR均取决于重复次数，其中2、3次重复次数下的FPR值大于1%，如果重复5次以上，所有FPR估计值都等于0。图3

图4

04
根据重复数从接受者操作特征（ROC）曲线评估控制FDR的最佳阈值上一节，作者针对FDR的固定阈值（0.01）计算TPR和FPR，下面作者研究了区间[0,1]中不同阈值对TPR和FPR的影响，图5显示使用DESeq2方法从2到7的每个重复次数获得的ROC曲线，结果发现增加重复数可以得到更佳的ROC曲线，最佳曲线对应于7个重复。其它3种方法也得到了相同的结果。控制FPR的最佳阈值大约等于2^-r（r为重复次数），2次重复为 0.25，3次重复为 0.12，4次重复为 0.06，依此类推，最后7次重复的最佳阈值是0.007。图6则显示了所有4种方法在2-7次重复中的ROC曲线。可以看出，对于每个重复数，DESeq 方法给出了最佳结果。直到重复数为5时，4种方法之间才具有极小的差异。
图5图605
TOGE数据的GO富集分析为了评估文库大小和重复数对GO BP类别检测的影响，作者使用goseq R软件包对文库大小和重复数的每个不同组合进行了GO富集分析。图 6 显示了真阳性和假阳性BP类别数量根据文库大小和重复数量的变化。8个重复的绿色条对应于获得的参考基因列表。结果显示，对于给定的重复次数，文库大小从2.5 M增加到20 M不会显著影响富集BP类别的数量。然而，当重复数从2增加到7时，BP类别的富集数量几乎增加了两倍。这些结果表明，BP类别的富集稳定性更多地取决于生物学重复数，而不是文库大小。图706
TomExpress 和 TOGE 数据的 DE 综合分析最后，作者对所有的 TomExpress 数据和上述的TOGE数据进行了 DE 综合分析。TomExpress是一个为番茄品种提供用于公共RNA-Seq数据处理的专用浏览器和工具。作者在17个项目上进行了分析，每个项目包含2到18个生物学条件，最多8个生物学重复和100 M读数，从而模拟所有项目的所有成对生物学条件的所有可能的DE分析，以匹配不同的重复数量和文库大小。对于每种生物学条件，模拟了2-21次重复，文库大小为 5、10、15、20 和 25 M reads（每次模拟重复3次）。然后进行DE分析以提取阈值为0.05的DE基因数量以控制FDR。结果如图8所示，可以看出，我们至少需要 4 次重复和 20 M reads才能获得大量 DE 基因，即大约 1000 个 DE 基因（红色箱线图的最小值）。显然，这1000个DE基因大致对应于计算机中可以找到的最小基因，只有其他实验方法（如qPCR分析）才能验证差异表达的基因。然后，为了获得几乎相同数量的DE基因，无论研究哪种条件，我们都需要大约5个或6个重复，分别有10 M和15 M reads。我们还可以从图8中看到，在全基因组范围内，新的DE基因的数量在10次重复后趋于最小。
图8



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